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92-1人葡萄膜黑色素瘤傳代方法

發(fā)布時(shí)間:2024-05-15瀏覽:475次

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92-1人葡萄膜黑色素瘤傳代方法

1、提前打開水裕鍋,加熱到37度,從液氮 罐中取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞;

2、放水裕鍋快速解凍(中途不要隨意拿出凍 存管直到凍存管中的液體全部融化)準(zhǔn)備細(xì) 胞專用培養(yǎng)基和無菌離心管培養(yǎng)基需提前預(yù) 熱

3、用完培稀釋凍存管中的細(xì)胞懸液至離心 管中收集細(xì)胞至元南離心管,800-1100 rp/5min,取出離心管,管底可見細(xì)胞沉淀

4、去除上清,用5ml完培重懸離心管中的 細(xì)胞液至T25瓶中,十字搖晃均勻;放入培 養(yǎng)箱,隔天觀察

傳代
1、準(zhǔn)備所需耗材紫外消毒30分鐘,觀察細(xì)胞密度 80%即可傳代; 2、去掉舊培養(yǎng)基,加入3mIPBS緩沖液輕輕潤洗后去 除,加入1ml胰酶,均勻覆蓋細(xì)胞表面(胰酶需提前預(yù) 熱); 3、細(xì)胞消化至變圓,輕拍瓶身滑落.加入4ml完培終 止消化,收集消化下來的細(xì)胞至無菌離心管, 800-1100 rpm/5min 4、取出離心管,管底可見細(xì)胞沉淀,準(zhǔn)備兩個(gè)T25,各加入2.5ml培養(yǎng)基; 5、離心管內(nèi)去上清,用5ml完培重細(xì)胞懸液,分裝至 2個(gè)T25瓶,十字搖晃均勻放入培養(yǎng)箱,隔天觀察;

特殊細(xì)胞收到注意事項(xiàng)

部分細(xì)胞由于貼壁不牢在運(yùn)輸過程中發(fā)生細(xì)胞脫落,這是正?,F(xiàn)象正確處理后都可以正常生長。 1、將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管,離心收集細(xì)胞(1200rpm3-5min)去除舊培養(yǎng)基; 2、用PBS重懸細(xì)胞,將所有細(xì)胞收集到一個(gè)離心管中,再次離心(1200rpm3-5min)去除PBS3、加入1ml左右0.25%胰酶重懸細(xì)胞,混勻即可,不能吹打太多次,放入培養(yǎng)箱消化,根據(jù)細(xì)胞特性決定消化時(shí)間(約1~2分鐘) 4、消化好后,用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液,使細(xì)胞團(tuán)分散,迅速加入3-5ml培養(yǎng)基混勻以終止消化,離心 (1200rpm3-5min) 去除胰酶; 5、加入5ml左右的細(xì)胞相應(yīng)的培養(yǎng)基混勻,按比例接入無菌培養(yǎng)瓶/皿中; 6、顯微鏡下觀察看細(xì)胞是否成均勻分散的單顆細(xì)胞,若有3-5個(gè)成團(tuán)的小細(xì)胞團(tuán)可不用重新消化,使之貼壁后待細(xì)胞生長穩(wěn) 定后再消散細(xì)胞。


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